人全譜甲基化測序(Methylome-seq)

— —臨床樣本甲基化檢測精確方案

臨床樣本甲基化研究涉及的樣本種類較多及樣本數量較多的特點，艾斯基因研發團隊開發了Acegen MethylDesignTM甲基化捕獲系統——先轉化后正負鏈同時捕獲的技術策略，推出了人全譜甲基化測序產品（Methylome-seq）; 該產品覆蓋 >2M個CpG位點, >25,000個CpG Island約20 Mb 區域, 多方位覆蓋UCSC, Ensembl, ENCODE等數據庫關注的重要甲基化位點和基因組元件，例如啟動子, CG島, 增強子等；普遍用于臨床樣本的全基因組范圍甲基化研究，包含全血、新鮮冷凍組織、石蠟切片、液體活檢樣本, 例如血漿/血清cfDNA、尿液、各類灌洗液等。作為組織活檢和液體活檢的甲基化研究方案，用于疾病分子分型、甲基化biomarker篩選、癌癥早篩、MRD檢測及復發檢測等幾乎所有應用場景，是臨床樣本甲基化檢測的進展方案。

重要技術產品，用心服務每一個項目

艾斯團隊專注表觀組學12年，提供DNA甲基化完整解決方案；

每年服務100+海外和國內企業及200+高校和醫院等客戶;

國內較早提供組織&液體活檢甲基化的解決方案;

已經完成3000+例樣本甲基化項目經驗；

涉及復雜 (FFPE)及微量樣本(cfDNA)多種樣本類型項目;

自動化樣本處理、建庫及分析流程，保障高效周期，40天極速交付;

專業的生物信息分析團隊, 提供更多個性化分析思路和方案

樣本類型和要求

數據信息分析

常見問題

Q1：為什么人Methylome-seq是臨床樣本甲基化檢測精確方案？

臨床樣本異質性較高，課題設計需要較多的樣本，少則幾十, 多則上百例；全基因組亞硫酸亞測序WGBS成本高、測序深度偏低，檢測準確性低等劣勢。人全譜甲基化測序Methylome-seq以相對較低的測序數據（例如每個樣本測8-10G數據, PE150測序），多方位覆蓋UCSC, Ensembl, ENCODE等數據庫關注的重要甲基化位點和基因組元件，例如啟動子, CG島及增強子等。且Methylome-seq檢測甲基化水平與WGBS甲基化水平有很高的相關性。有效測序深度達到了>100X，因此具有更為準確的甲基化檢測準確性，更適合臨床樣本精確甲基化檢測研究。

850K甲基化芯片，覆蓋的CpG位點主要在CpG島、啟動子及增強子等區域，設計覆蓋0.85M左右的CpG位點；甲基化芯片基于甲基化分析平臺MethylationEPIC 850K BeadChip, 采用Oligo nucleotide雜交技術，芯片的批次效應（batch effect）有時會較嚴重，制約了其在臨床樣本精確甲基化檢測的應用。

WGBS、850K芯片及全譜甲基化Methylome-seq在檢測準確性、樣本類型及成本因素的比較，如下圖示的“蒙娜麗莎的笑臉”。這3種技術檢測基因組CpG覆蓋范圍, 依次為WGBS > Methylome-seq > 850K芯片；甲基化檢測準確性是由測序深度決定的, 依次為全譜Methylome-seq > WGBS > 850K芯片；同時，全譜甲基化Methylome-seq適合常規及液體活檢樣本，且檢測成本適中，因此更適合臨床樣本精確甲基化檢測研究。

Q2：血漿/血清cfDNA樣本準備有哪些注意事項（附件1）

抽血離體之后ctDNA會繼續降解、含量逐步減少；而來自白血細胞的cfDNA持續進去血漿，進而稀釋ctDNA濃度，降低檢測信號。因此，在采血、血漿分離及保存運輸，每一步操作都會影響數據的質量。

建議使用Streck等采血管，合作項目，提供采血管！

案例分析: GRAIL基于cfDNA甲基化泛癌早檢和組織溯源

Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Ann Oncol. 2020 Jun;31(6):745-759.

研究方案：早期癌癥檢測可以在預后更好、治療不那么病態的時候發現腫瘤。本項目通過前瞻性病例-對照子研究評估了cfDNA靶向甲基化分析的性能，以評估在高特異性檢測和定位各個階段的多種癌癥類型。6689名參與者[2482名癌癥患者（>50種癌癥類型），4207名非癌癥患者]被分為訓練組和驗證組。血漿cfDNA經過亞硫酸氫鹽測序，靶向超過10萬個甲基化區域，用于開發并驗證癌癥檢測和起源組織（TOO）定位的分類器。

研究結果： 檢測技術性能在訓練集和驗證集中表現一致。在驗證中，特異性為99.3% [95%置信區間(CI)：98.3%至99.8%；0.7%假陽性率(FPR)]。在預先設定的12種癌癥類型（肛門、膀胱、結腸/直腸、食管、頭頸部、肝/膽管、肺、淋巴瘤、卵巢、胰腺、漿細胞腫瘤、胃）中，I-III期敏感性為67.3%（CI:60.7%至73.3%），占美國每年癌癥死亡的63%，在所有癌癥類型中為43.9%（CI:39.4%至48.5%）。檢測靈敏性隨分期的增加而增加：在預先指定的癌癥類型中，I期的敏感性為39%（CI:27%至52%），II期的敏感性為69%（CI:56%至80%），III期的敏感性為83%（CI:75%至90%），IV期的敏感性為92%（CI:86%至96%）。在所有癌癥類型中，I期的敏感性為18%（CI:13%至25%），II期的敏感性為43%（CI:35%至51%），III期的敏感性為81%（CI:73%至87%），IV期為93%（CI:87%至96%）。在96%的癌樣中能檢出組織溯源TOO信號，TOO定位準確率為93%。

圖1. CCGA研究課題：基于cfDNA的多種癌癥檢測方法的開發和驗證

圖2. 靶向甲基化cfDNA檢測性能