目標區域 DNA 甲基化測序(Targeted Bisulfite Sequencing)

— — 基于 Acegen Targeted Methyl Panel 定制化系統

除了全基因組甲基化測序技術等研究手段，對于目標基因/CpG 位點甲基化檢測，需要靈活的靶向甲基化測序方案; 基于亞硫酸鹽多重 PCR 捕獲重點技術和NGS 高深度測序的目標區域甲 基化測序 Targeted Bisulfite Sequencing, 滿足幾個到上百個基因/CpG 位點的檢測, 具有高準確性、高通量、低成本、快周期的優勢；普遍用于臨床樣本多位點的甲基化 Biomarker 篩選、驗證及臨床轉化應用。

艾斯基因研發團隊突破甲基化多重 PCR 技術及引物批量設計難題，多方面推出 Acegen Targeted Methyl Panel 定制服務，讓靶向甲基化測序變得簡單！

技術優勢

? 基于亞硫酸鹽多重 PCR 擴增捕獲測序

? 高效靈活的目標區域甲基化檢測方案

? 深度測序, 單堿基分辨率, 絕對定量的

? 可同時檢測幾百個區域/CpG 位點

? 普遍用于血液、組織、灌洗液、糞便等

? 低成本、快周期的，超高性價比優勢

重點技術產品，用心服務每一個項目

艾斯團隊專注表觀組學 10 年，提供 DNA 甲基化完整解決方案；較早開發 TBS 技術團隊之一, 國內較早推出靶向甲基化 TBS 定制化服務； 已經完成血液、組織、糞便等多種類型，10000+例樣本 TBS 項目經驗; 重點團隊在 Genome biology、DNA Res 等雜志發表多篇 SCI 論文；專業的生物信息分析團隊, 提供更多個性化分析思路和方案。

樣本類型和要求

數據信息分析 

Acegen Targeted Methyl Panel 技術指標

Acegen Targeted Methyl Panel 具有技術重復性好、樣本輸入量低、抗背景干擾等前沿的技術優勢；滿足更多常規科研及臨床特殊樣本，例如肺泡灌洗液、糞便、尿液等樣本甲基化檢測；如下圖所示：

案例分析 1：DNA 甲基化異常用于甲狀腺結節診斷

Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics.

Clin Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551 (IF= 10.199)

本課題通過 RRBS 檢測了 109 個甲狀腺組織的 DNA 甲基化，發現癌旁、良性結節和癌組織之間存在明顯差異，并在 65 個甲狀腺結節的回顧性隊列樣本中得到驗證。這些組織特異性DMR 與活性增強子和癌癥相關基因密切相關，表明 DNA 甲基化為甲狀腺結節提供準確的診斷。并開發及驗證了基于靶向甲基化測序 TBS (Target Bisulfite Sequencing) 用于甲基化多位點甲狀腺結節診斷的轉化應用方案的重要價值。

圖 1. 鄰近甲狀腺組織、良性和惡性結節的 DNA 甲基化差異聚類

圖 2、靶向甲基化測序 TBS 用于甲基化多位點甲狀腺結節診斷

案例分析 2：血清游離 DNA 甲基化 biomarker 用于乳腺癌轉移早期篩查

Methylation patterns in serum DNA for early identification of disseminated breast cancer.

Genome Med. 2017;22;9(1):115..

本課題通過RRBS 檢測了 31 個樣本，其中癌組織(n=8)和白細胞(n=23)的 DNA 甲基化，篩選出 18 個癌癥特異的 DMR, 進一步通過 TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 在兩個樣本庫(>1000 例)的血漿cfDNA 中驗證，找到血清EFC#93 用于早期識別彌散性乳腺癌的biomarker.

圖 1. 課題設計方案

圖 2、英國 CTOCS 血清試驗女性樣本中 EFC#93 甲基化頻率

案例分析 3：循環腫瘤 DNA 甲基化 biomarker 用于肝癌診斷和預后

Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nat Mater. 2017;16(11):1155-1161.

本課題通過 TCGA 數據庫篩選 401 個甲基化 Biomarker, 在 1933 例血漿中進行基于靶向亞硫酸鹽測序(Targeted Bisulfite Sequncing, TBS) ，通過與臨床樣本信息進行關聯分析，最終篩選了10 個 HCC 診斷和 8 個 HCC 預后預測的甲基化 Biomarker.

圖 1、課題方案設計

圖 2、cfDNA 甲基化 biomarker 用于 HCC 診斷

案例分析 4：乳腺癌中 48 個基因甲基化普研究

Methylation pro?ling of 48 candidate genes in tumor and matched normal tissues from breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat. 2015;149(3):767-79.

PubMed 文獻檢索與癌癥相關的 48 個基因，180 例乳腺癌患者配對的癌和癌旁組織樣本庫中， 通過 TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 檢測這 48 個基因啟動子甲基化，篩選出 13 個基因(CST6、DBC1、EGFR、GREM1、GSTP1、IGFBP3、PDGFRB、PPM1E、SFRP1、

SFRP2、Sox17、TNFRSF10D 和 WRN)為標志物，構建乳腺癌高效率的癌癥預測模型。

圖 1、Boxplot 展示在 4 個乳腺癌亞型中 PTGS2 和 RUNX3 基因甲基化水平

圖 2. 基于 48 個基因啟動子甲基化水平的癌和癌旁聚類

案例分析 5：靶向亞硫酸鹽測序發現食管鱗癌甲基化 biomarker

Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).Clin Epigenetics. 2017. 15;9:129.

基于 TCGA 數據庫(450K 芯片)等數據，第一步篩選了 5 個潛在甲基化 biomarker，第二步通過 TBS (Target Bisulfite sequencing) 在 94 對 ESCC 樣本中驗證和評估，由 5 個 CpG 位點Panel 的診斷模型具有很好的指標(sensitivity=0.75, specificity=0.88, AUC=0.85)。

圖 1. 5 個基因組區域 CpG 位點的甲基化狀態

圖 2、腫瘤與正常組織平均甲基化狀態以及總 ROC 曲線

常見問題

Q1：為什么 TBS 代替傳統 BSP 克隆測序和焦磷酸測序?

目前甲基化驗證環節主要有以下 3 種金標準方案：1) 傳統 BSP: 對 BSP 產物進行 TA 克隆， 選擇 10-30 個克隆進行測序，計算甲基化水平；由于實驗步驟多，選擇克隆數量有限，因此檢測準確性不高，檢測費用卻很高，目前很少使用；2) 甲基化焦磷酸測序：對 BSP 產物進行直接焦磷酸測序，很好地替代了傳統 BSP，可以檢測 3-5%的甲基化差異，同時降低了檢測成本(200 元/位點區域), 因此具有較好的使用價值；3) TBS (通常又叫做高通量 BSP)：結合了多重 PCR 擴增的高效性和二代高通量測序的準確性，同時又解決了傳統 BSP 和焦磷酸測序按照位點/區域收費的高成本模式，實現了按照樣本收費(與每個樣本檢測位點/區域數無關), 因此普遍應用于高水平甲基化驗證環節。

上圖. 3 種檢測流程，亞硫酸鹽處理及擴增步驟是一致的

Q2：TBS 檢測準確性優勢：高深度、絕對定量、高準確性

靶向甲基化測序 TBS panel，類似基因突變檢測 Panel；是通過靶向高深度測序(幾百到上千測序深度)，統計出來的甲基化水平，因此可以對目標區域的每個 CpG 位點進行絕對定量， 具有更高的準確性。

Q3：TBS 測序結果展示形式有哪些？

通過對目標位點/區域的每個位點甲基化水平進行定量，可對每個位點進行組間明顯性統計， 具有多種形式的展示形式；并且可以根據樣本臨床信息，進行關聯分析。

圖 1、目標區域各 CG 位點甲基化水平分布示意圖

圖 2、多樣本甲基化水平聚類熱圖

圖 3、目標區域 CG 甲基化水平組間比較

Q4：TBS 還是焦磷酸測序？ 成本考慮

與傳統的亞硫酸鹽 TA 克隆測序及甲基化焦磷酸測序不同, TBS (高通量 BSP 測序) 通過對目標位點/區域的多重擴增 (Acegen Targeted Methyl Panel)，在一次實驗中獲得幾十到幾百位點的金標準檢測，具有更靈活的位點檢測的方便性，同時也具有更好的成本優勢。通常焦磷酸測   序是按照反應數進行收費的，單樣本檢測費用與檢測位點數正比例；TBS 費用與單樣本檢測位點/區域數無關，而且隨著檢測樣本量的增加，TBS 的規模優勢更大，體現在檢測周期及費用的進一步的沉降潛力。