今天介紹的這篇論文是2023年10月12日暨南大學醫學院公共衛生與預防醫學系的郝光團隊在BMC Medical Genomics 雜志發表題為“The potential DNA methylation markers of cardiovascular disease in patients with type 2 diabetes ” 的研究論文，該研究利用RRBS和TBS測序探究了患有心血管疾病的2型糖尿病患者的潛在DNA甲基化標記物。艾斯基因為該研究提供了RRBS和TBS測序技術服務。

心血管(CV)疾病占死亡人數的52%，是2型糖尿病(T2D)患者死亡的主要原因。T2D患者死于心血管疾病的可能性是非T2D患者的2-6倍。越來越多的證據表明，DNA甲基化在心血管事件的發展中起著至關重要的作用。例如，ABCG1基因的甲基化水平被報道與心血管疾病的風險呈正相關。SERPINE1基因的高甲基化水平與一些心臟代謝指標(腰圍、腰臀比、尿酸)存在顯著相關性。異常DNA甲基化是血管病變的關鍵決定因素之一，因此被認為是糖尿病患者預防和診斷心血管風險的有用生物標志物。然而，DNA甲基化在心血管疾病發展中的作用有待進一步研究。

技術方案：RRBS、TBS等（由艾斯基因提供技術服務）。樣本類型：10例有/無CV疾病的糖尿病患者作為病例組和對照組（發現隊列）；100例有/無CV疾病的糖尿病患者作為病例組和對照組（驗證隊列）

表1 研究人群的基本特征

在發現隊列中，病例組和對照組之間沒有統計學差異。在驗證隊列中，受教育程度、尿蛋白和頸動脈粥樣硬化有統計學差異(P < 0.05)。

圖1差異甲基化位點(DMRs)在發現隊列中的分布。

研究人員使用RRBS探究發現隊列中的甲基化譜。結果表明，在20259個DMRs中，12981個DMRs (6382個降低，6599個升高) 在患有和未患有CV疾病的T2D患者之間差異顯著(FDR<0.01)。57.19%的甲基化位點位于基因區中，22.57%位于啟動子中。

圖2 23個驗證的差異甲基化位點(DMRs)

根據GO富集、KEGG富集和文獻綜述的結果，研究人員初步選擇了127個DMRs進行進一步驗證。在這些DMRs中，87個DMRs的亞硫酸鹽測序引物成功設計用于TBS分析。共有23個DMRs包括25個基因被進一步驗證。12個基因被高甲基化(LMF1、FZD5、COL6A1、TBX1、CACNA1D、PTPRN2、NEFL、RXRA、G6PD、IKBKG、ADCY6和WNT7A)，13個基因被低甲基化(PIK3CD、PDE4DIPP1、H19、MIR675、ARSG、PNPLA6、CRYGEP、TNIP1、PON1、COL5A1、KDM6A、CREB5和SERPINE1)。其中，ARSG、PNPLA6、NEFL、CRYGEP 4個基因為這項研究首次報道的。

圖3 基于排名前9位的重要變量進行基線預測模型。

研究人員對表1中32個潛在變量進行隨機森林分析，其中9個Mean reduction Accuracy值>0.5的變量（餐后血糖、吸煙狀況、周圍神經病變、空腹血糖、頸動脈粥樣硬化、職業、受教育程度、高敏c反應蛋白(hsCRP)、高血壓）被納入預測模型，AUC為69.2%。

圖4 差異甲基化位點通路富集。

作者對DMRs對應的基因進行GO和KEGG富集分析，發現22個KEGG和17個GO通路顯著富集(FDR < 0.05)。這些通路與CV并發癥(如II型糖尿病、阿爾茨海默病、庫欣綜合征和擴張型心肌病)、癌癥(如胃癌、乳腺癌、肝細胞癌)、炎癥通路(如調節干細胞多能性的信號通路、mTOR信號通路、hipp信號通路、pi3k-Akt信號通路、cAMP信號通路)。

圖5 基因表達蛋白的空間與平面相互作用示意圖。

DNA甲基化與心血管(CV)疾病有關。然而，在2型糖尿病(T2D)患者中，基因甲基化在心血管疾病發展中的作用尚未得到充分研究。研究人員旨在確定T2D患者中與CV疾病相關的DNA甲基化位點，并使用兩階段設計探索CV疾病發展的潛在途徑。參與者來自濟南糖尿病隊列研究(Jinan Diabetes Cohort Study ，JNDCS)，這是一項正在進行的縱向研究，旨在評估T2D患者發生心血管疾病的風險。在發現隊列中，隨機選擇10例有CV疾病的糖尿病患者作為病例組，另外10例無CV疾病的糖尿病患者按性別、年齡、吸煙狀況、體重指數匹配作為對照組。在1438例無CV疾病的T2D患者中，經過平均6.5年的隨訪確定了210例患有CV疾病。在驗證隊列中，在隨訪期間隨機選擇100例患有CV疾病的患者作為病例，隨機選擇100例未患有CV疾病的的患者作為對照組。RRBS和TBS分別用于測量發現和驗證隊列中的甲基化譜。在發現隊列中，在T2D患者中發現了127例與CV疾病相關的DMRs。研究人員進一步驗證了23個DMRs與25個基因的關聯，其中4個基因(ARSG、PNPLA6、NEFL和CRYGEP)為首次報道。除此之外，DNA甲基化數據的加入提高了T2D患者心血管疾病的預測性能。通路分析確定了一些與CV合并癥、T2D和炎癥有關的重要信號通路。